'Night at the Museum' er en action-komedie, hvis handling vækkes til live i nattetimerne. Den godhjertede dagdrømmer Larry Daley (Ben Stiller) føler, at han er bestemt til at udrette noget stort på trods af at uheldet ellers synes at ramme ham gang på gang.

Men at jobbet som nattevagt på det nationalhistoriske museum ville føre til 'noget stort' i bogstaveligste forstand havde Larry formodentlig aldrig i sin vildeste fantasi forestillet sig.

Mystiske begivenheder finder pludselig sted under en af Larrys nattevagter. Historiske skikkelser og væsener i form af bl.a. gladiatorer, cowboys og dinosaurer bliver levendegjort i nattens mulm og mørke.

Inden Larry har set sig om udspiller der sig et væld af kampe i museets mørke gange, og den eneste han kan søge hjælp hos i håbet om at stoppe urolighederne og redde museet er Præsident Roosevelt (Robin Williams).